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Communications Biology volumen 6, Número de artículo: 528 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

El descubrimiento y la caracterización de clonotipos de células T CD8+ específicas de antígeno normalmente implican la síntesis y construcción de tetrámeros de péptido-MHC que requieren mucha mano de obra. Adaptamos las tecnologías de trímero de cadena única (SCT) en una plataforma de alto rendimiento para la generación de bibliotecas pMHC, lo que demuestra que se pueden preparar cientos rápidamente en múltiples alelos HLA de Clase I. Usamos esta plataforma para explorar el impacto de las mutaciones de la plantilla de péptidos y SCT en el rendimiento de la expresión de proteínas, la estabilidad térmica y la funcionalidad. Las bibliotecas SCT fueron una herramienta eficaz para identificar las células T que reconocen los epítopos virales comúnmente informados. Luego construimos bibliotecas SCT para capturar células T CD8+ específicas de SARS-CoV-2 de participantes con COVID-19 y donantes sanos. La inmunogenicidad de estos epítopos se valida mediante ensayos funcionales de células T con TCR clonados capturados mediante bibliotecas de SCT. Estas tecnologías deberían permitir los análisis rápidos de las respuestas de las células T basadas en péptidos en varios contextos, incluidos la autoinmunidad, el cáncer o las enfermedades infecciosas.

La aparición constante de nuevas cepas de virus patógenos ha impulsado la necesidad de enfoques de alto rendimiento para la producción de reactivos basados en epítopos1. En particular, los reactivos del complejo principal de histocompatibilidad de péptidos (pMHC), utilizados para capturar células T específicas de antígeno y extraer genes de receptores de células T (TCR) relevantes, son herramientas fundamentales para interrogar epítopos inmunodominantes en las respuestas inmunitarias del huésped. Dichos reactivos también son clave para evaluar de manera eficiente las vacunas emergentes o las terapias basadas en células que están diseñadas para promover respuestas de células T específicas de antígeno contra la enfermedad. Estas terapias suelen estar guiadas por algoritmos de predicción de epítopos basados en HLA, que pueden generar cientos de antígenos putativos por alelo HLA. Para adaptarse a esta escala, existe una gran necesidad de bibliotecas de reactivos pMHC solubles preparados de manera de alto rendimiento para identificar TCR específicos de antígeno de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de individuos con diversos alelos HLA.

Los pMHC solubles se producen convencionalmente mediante la expresión de las subunidades del MHC dentro de Escherichia coli, seguido del replegamiento in vitro de la cadena pesada HLA y los cuerpos de inclusión de la subunidad β2-microglobulina (β2m) en presencia de un péptido diana2. Una versión modificada incorpora un péptido escindible con luz ultravioleta (UV) en el pMHC3,4,5, lo que permite la producción rápida de bibliotecas de pMHC a través de la escisión UV seguida del intercambio de antígenos. Por lo general, el rendimiento total de proteínas de tales métodos depende de HLA y péptidos, y los reactivos producidos por cualquiera de los métodos tienen una vida útil limitada.

Los trímeros de cadena única (SCT) proporcionan una construcción pMHC alternativa que puede abordar estos problemas6,7,8. Brevemente, una construcción de plásmido pcDNA3.1 codifica la señal de secreción de la proteína IFNα2 (MALTFALLVALLVLSCKSSCSVG)9, el péptido, el conector péptido-β2m (L1), β2m, el conector β2m-HLA (L2), HLA y las etiquetas de purificación de proteínas, y el péptido- La construcción L1-β2m-L2-HLA se secreta como una proteína. Las SCT se adoptaron en los sistemas de expresión de mamíferos, lo que permitió mejoras significativas en el rendimiento general de proteínas, presumiblemente debido al uso de mecanismos internos de control de calidad y plegamiento de proteínas8. También se diseñaron SCT con mutaciones de bolsillo de unión para minimizar la influencia funcional del conector peptídico y mejorar la inmunogenicidad de los reactivos pMHC10,11,12,13. Recientemente, el sistema SCT se adaptó a las células Expi293 para maximizar la cantidad de expresión. La modularidad peptídica se introdujo mediante la recombinación homóloga de fragmentos de ADN codificados por péptidos en el plásmido para permitir la producción y la caracterización funcional de dos SCT que codifican péptidos virales HLA-A*24:0214. Estos trabajos apuntan al uso potencial de SCT como alternativas funcionales para construir bibliotecas pMHC, que es la vía que exploramos aquí.

Describimos una plataforma de alto rendimiento que permite la producción de SCT para cualquier combinación de péptido y alelo HLA de clase I. Mientras que el plegamiento de pMHC, el epítopo y la modularidad de HLA están determinados por la síntesis de péptidos y el replegamiento de las subunidades de MHC expresadas, respectivamente, la plataforma SCT utiliza un cebador y un plásmido de plantilla de PCR para determinar estas dos variables. La naturaleza fácil de manejar y escalar estos reactivos de PCR permite un enfoque de mezcla y combinación que permite examinar rápidamente una biblioteca de péptidos y variantes de plantilla de HLA. Primero demostramos un caso de prueba de 18 antígenos asociados a tumores (TAA) para HLA-A*02:01, utilizando nueve plantillas L1/HLA diferentes para evaluar el impacto del péptido y la plantilla L1/HLA en la expresión de proteínas SCT y la estabilidad térmica. A continuación, destacamos la funcionalidad de SCT en un contexto de enfermedad al demostrar SCT cargados con epítopos derivados de cepas virales comunes. Luego utilizamos nuestra plataforma SCT para permitir la evaluación de cientos de epítopos virales, lo que culmina con el descubrimiento de epítopos inmunodominantes en dos dominios de proteína SARS-CoV-2 y el aislamiento de sus TCR afines. Finalmente, clonamos y caracterizamos funcionalmente la capacidad de destrucción citotóxica de los clonotipos de células T CD8+ descubiertos utilizando el enfoque de la biblioteca SCT, validando la utilidad de esta estrategia.

El protocolo para la preparación de la biblioteca SCT se presenta en la Fig. 1a. Primero se convirtió una lista de péptidos en cebadores de ADN optimizados para PCR. La PCR inversa de cada cebador codificado por péptido en una plantilla de plásmido SCT y la recircularización del producto generaron cada variante peptídica única de una biblioteca de plásmidos. A continuación, los plásmidos se transfectaron en células Expi293 durante cuatro días para inducir la secreción del producto proteico SCT. Luego, el rendimiento de la proteína SCT expresada se caracterizó mediante un script de Python personalizado para el análisis de gel de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (Fig. 1a-c complementaria), seguido de biotinilación y purificación de His-Tag.

un flujo de trabajo de producción de SCT. Gel SDS-PAGE reducido que muestra proteína SCT expresada (~50 kDa); SN sobrenadante, SCT purificado con P His-Tag. b Viabilidad celular y eficiencia de transfección de la biblioteca de plásmidos SCT. c Rendimiento de SCT de cada elemento peptídico de la biblioteca de plásmidos SCT, con o sin indicador IRES-GFP. Las barras de error representan la desviación estándar, n = 3 mediciones independientes. d Gel SDS-PAGE reducido de A*02:01 y A*24:02 SCT antes y después del tratamiento con PNGase. Los motivos de glicosilación NXT de péptidos están subrayados.

Para explorar la influencia del antígeno peptídico en el rendimiento de SCT, preparamos una biblioteca de 18 SCT que representan epítopos HLA-A * 02: 01 conocidos (Tabla complementaria 1) utilizando una plantilla D3 (ver más abajo). El protocolo de la Fig. 1a se modificó para incorporar una secuencia IRES-GFP después de la región SCT, de modo que independientemente de la identidad peptídica o el nivel de expresión de SCT, las células transfectadas expresarían GFP15 intracelular (Fig. 1b, c). La detección basada en citometría de flujo de células positivas para GFP indicó que la eficiencia de transfección (~ 70 %) fue uniforme en todas las construcciones SCT probadas (Fig. 1b). Un triplicado biológico de este subconjunto, con y sin el inserto IRES-GFP, demostró variaciones consistentes en el rendimiento de SCT, lo que sugiere que los epítopos de péptidos individuales influyen fuertemente en el rendimiento de sus elementos de la biblioteca SCT (Fig. 1c).

Los SCT se expresan en células de mamíferos y, por lo tanto, pueden incorporar modificaciones postraduccionales que no se presentarían en los pMHC plegados. Exploramos este efecto centrándonos en los epítopos que contenían la secuencia de consenso de glicosilación de NXT. De hecho, para los SCT que contienen tales secuencias, el análisis SDS-PAGE reveló una masa ligeramente elevada, cuyo origen podría confirmarse analizando los SCT después de la desglicosilación (Fig. 1d). Por lo tanto, los SCT pueden someterse a un procesamiento biológico de proteínas y, por lo tanto, tienen el potencial de contener modificaciones postraduccionales relevantes.

También comparamos los rendimientos de la biblioteca SCT frente a las bibliotecas pMHC generadas por intercambio UV. Comenzando con neoantígenos putativos restringidos A*03:01 predichos de un paciente con melanoma16, los SCT se ensamblaron utilizando las plantillas D3 y D8 (consulte una descripción más completa de estas plantillas a continuación), mientras que la biblioteca de pMHC se preparó mediante intercambio UV utilizando protocolos de la literatura3,5 . Se realizó un ensayo ELISA que midió la absorbancia del anticuerpo anti-β2m para cuantificar la eficiencia de intercambio UV para cada elemento peptídico de la biblioteca. Una comparación de los rendimientos de SCT y las eficiencias de intercambio de UV para cada péptido (Fig. 1d complementaria) mostró que los péptidos que conducen a una alta expresión de SCT generalmente también se intercambian bien en UV-pMHC, y viceversa.

A continuación, construimos una biblioteca SCT ampliada con los 18 epítopos HLA-A*02:01 analizados anteriormente y exploramos las funciones que varias mutaciones de la plantilla L1/HLA notificadas ejercían tanto en el rendimiento de la expresión SCT como en el rendimiento SCT como un agente de captura de células T específico de antígeno. . Tres generaciones de combinaciones de L1-HLA [surco cerrado (HLA de tipo salvaje), surco abierto (HLA Y84A) y enlazador de tiol (HLA Y84C)] se han informado como estabilizadores (consulte la Fig. 2a para conocer las ubicaciones de estos residuos mutados) . Introdujimos estas variantes genéticas en cinco diseños únicos, D1–D910,11,12 (Fig. 2b). Los diseños que contienen cisteína en el enlazador (D3–D5) incorporan la mutación HLA Y84C para completar un enlace de ditiol. Tres plantillas también contenían una mutación H74L13 (D6–D8), que forma una parte del bolsillo C en el surco de unión de péptidos de la subunidad HLA y se ha informado que facilita la carga de péptidos y la inmunogenicidad. Nuestro diseño final (D9, denominado DS-SCT) se inspiró en un informe reciente de que la mutación Y84C-A139C en la molécula HLA podría introducir una mayor estabilización17,18,19. Esta biblioteca de plásmidos de 162 elementos (9 plantillas HLA × 18 péptidos) se transfectó en células Expi293 (Fig. 2b). Las cantidades reducidas de las bandas de proteína SCT basadas en el análisis SDS-PAGE se asociaron con variaciones en el rendimiento de proteína dependiente del péptido y la plantilla (Fig. 2b). Las plantillas que contenían enlazadores tiol (D3–D9) produjeron los rendimientos generales más altos. Para ciertos péptidos, como AIQDLCLAV y AIQDLCVAV, la fuerte expresión solo se pudo obtener con la plantilla D8, que incorpora características tanto de H74L como de enlace tiol.

una Vista axial de la estructura cristalina HLA-A*02:01 SCT (RDB ID: 6APN). Regiones de interés resaltadas: H74 (azul), Y84 (verde), A139 (cian) y los primeros tres aminoácidos del enlazador L1 (negro). b Tabla: Modificaciones de aminoácidos L1 y HLA para cada plantilla SCT. Mapa de calor: expresión relativa de cada combinación de SCT (n = 3), designada por plantilla (fila) y péptido (columna), y ejemplificada por SDS-PAGE reducida de 18 SCT construidas usando la plantilla de diseño D9. Una alícuota previamente expresada y purificada de WT1 SCT se utiliza como control positivo (+) para la cuantificación de la intensidad de la banda. c Perfiles de fusión térmica de SCT. El negativo del cambio de fluorescencia sobre el cambio de temperatura (-δF/δT) se mide para los SCT que codifican el péptido WT1 (ci). Los mínimos locales que representan los valores de Tm (ver la región encuadrada de la gráfica WT1) se trazan (c.ii) para cada molde y péptido SCT (n = 3). d Los SCT WT1 construidos de acuerdo con cada uno de los seis diseños de plantilla se emparejaron con un SCT MART-1 (plantilla D3) para identificar células transducidas con TCR afines. El número/color en la parte superior derecha de cada gráfico indica la plantilla SCT utilizada para el tetrámero WT1 SCT en el ensayo de flujo. Los porcentajes indican la proporción de la población celular total capturada en el cuadrante WT1 SCT positivo. e Captura de células T específicas de CMV mediante SCT o formato pMHC replegado. Clonotipos de TCR emparejados únicos identificados por secuenciación de células individuales 10x de células positivas para tetrámero. Las secuencias de CDR3a y CDR3b de los doce clonotipos capturados con mayor frecuencia desde el tetrámero SCT junto con LD hasta los clonotipos específicos de CMV informados públicamente de VDJdb se informan en la Tabla. Enlazador L1 1, WT1 RMFPNAPYL, MART-1 ELAGIGILTV, CMV NLVPMVATV, distancia LD Levenshtein, base de datos VDJdb VDJ, aloficocianina ACN, ficoeritrina PE.

Exploramos la estabilidad térmica de esta biblioteca SCT a través de ensayos de cambio térmico, que utilizan fluorimetría de barrido diferencial para medir la intensidad de un tinte fluorescente (naranja SYPRO) que se une a las regiones hidrofóbicas de la proteína. Las proteínas menos estables térmicamente exhiben temperaturas de fusión más bajas. Los SCT que se expresaron por encima de un umbral de rendimiento se purificaron con HisTag en tampón PBS a pH 7,4. Los valores de Tm medidos estuvieron dentro de los rangos esperados de la literatura20 y revelaron una tendencia de mayor estabilidad para el mismo péptido de ranura cerrada a ranura abierta a conector/ranura tiolado (Fig. 2c.i-ii). Para tres péptidos (YMLDLQPET, YMLDLQPETTDL y RMFPNAPYL), se demostró que los pMHC plegados mostraban una Tm relativa más alta que sus contrapartes SCT (Fig. 2c.ii). En todos los péptidos, las estabilidades térmicas de SCT también fueron más altas para las variantes de H74L que para las contrapartes de tipo salvaje. Para algunos péptidos (como AIQDLCLAV) o algunas combinaciones de plantilla/péptido (como D7/YMLDLQPET), detectamos dos temperaturas de fusión distintas. Especulamos que la temperatura más baja surge de un SCT mal plegado, por lo que utilizamos el valor más alto en la Fig. 2c.ii (Fig. 2a complementaria).

Validamos la funcionalidad de las construcciones SCT para el péptido Wilms Tumor 1 (WT1) (RMFNAPYL) mediante la evaluación de la unión del tetrámero del C4αβ-TCR específico de WT1 frente a plantillas seleccionadas (la expresión de D1, D2 y D7 era demasiado baja para su uso) ( Figura 2d)21. Los SCT WT1 expresados se purificaron y luego se combinaron con células Jurkat transducidas con TCR F5 específicas de MART1 en una proporción de 95/5 para su uso en ensayos de unión. Utilizamos el tetrámero SCT presentador de epítopos MART1 (plantilla D3, Fig. 2b complementaria) como control estable. Para los tetrámeros SCT que presentan el epítopo WT1, las plantillas D3, D5 y D9 produjeron un rendimiento excelente, capturando selectivamente del 81 al 94,0% de la población celular específica de WT1 (Fig. 2d). Por lo tanto, el mejor rendimiento del tetrámero no se correlacionó necesariamente con la mayor estabilidad térmica. El diseño del D8 WT1 SCT, por ejemplo, se acerca más a la estabilidad térmica del pMHC plegado, pero tiene un rendimiento deficiente. Seleccionamos las plantillas D3 y D9 para experimentos adicionales, ya que ambas exhibieron una buena estabilidad térmica y un excelente rendimiento como reactivos de captura de células T específicas de antígeno.

A continuación, comparamos el rendimiento de captura de células T CD8+ específicas de antígeno de los multímeros SCT de plantilla D3 y los multímeros pMHC plegados mediante la obtención de secuencias de regiones CDR3 de cadenas α y β de TCR capturadas con estos reactivos. El péptido del epítopo de células T CD8+ CMVpp65 HLA-A*02:01 restringido (NLVPMVATV) se usó en el ensayo ELISPOT de interferón (IFN)-gamma para identificar un donante sano A*02:01 reactivo con CMV para este experimento. Este SCT CMVpp65 y su homólogo pMHC plegado se multimerizaron en dextrámeros con código de barras para aislar las células T específicas de CMV para la secuenciación TCR de una sola célula 10x. Los dos reactivos capturaron una distribución similar de clones específicos de antígeno (Fig. 2e). Las distancias de Levenshtein (LD) de las cadenas CDR3α y CDR3β frente a una base de datos pública (Fig. 2e, tabla) indicaron una gran similitud entre las cadenas de TCR específicas de CMV detectadas y las notificadas previamente22. Dos clones emparejados (gajos rojo y naranja claro de la Fig. 2e) coincidían exactamente con las secuencias de CDR3 de la literatura (LD = 0). Un clon adicional (cuña verde claro, Fig. 2e), que contiene un par α/β para el cual ambas cadenas han sido reportadas como específicas de CMV23,24, fue capturado por el SCT a una frecuencia diez veces mayor en relación con el pMHC plegado. Por lo tanto, los tetrámeros SCT parecen tener al menos un rendimiento de citometría de flujo similar al estándar de oro de los pMHC plegados.

A continuación, exploramos cómo se podrían usar las bibliotecas SCT para mejorar y optimizar los protocolos de la literatura para la captura de células T específicas de antígeno a través de la exploración sucesiva de tres métodos (Fig. 3a-d). Comenzamos con un protocolo establecido y luego usamos bibliotecas SCT para optimizar y simplificar ese protocolo. Usando la plantilla D3, primero expresamos una biblioteca SCT dirigida a 66 epítopos conocidos de cepas virales comunes (CMV, EBV, influenza y rotavirus) para A*02:01 y A*24:02 (Tabla complementaria 2). Luego seleccionamos los diez SCT más expresados para cada HLA y sintetizamos los péptidos correspondientes. Estos reactivos SCT y peptídicos se aplicaron luego en los tres métodos.

un flujo de trabajo de identificación de células T específicas de antígeno utilizando tetrámeros SCT (creado con BioRender.com). b Gráficas representativas de citometría de flujo de células T CD8+ capturadas por tetrámeros SCT combinados de 5 colores de células T CD8+ expandidas y estimuladas con péptidos (Método 1) (n = 10). c, d Gráficas representativas de citometría de flujo de células T CD8+ capturadas inicialmente por tetrámeros SCT agrupados de un solo color de células T CD8+ expandidas y estimuladas con péptidos (ci) (Método n.° 2) o de células T CD8+ no estimuladas y no expandidas ( di) (Método #3). Los diagramas de flujo subsiguientes representan las células IFNγ+ después de la estimulación peptídica de las células expandidas del subconjunto tetrámero positivo capturado previamente (c.ii, d.ii). e, Mapeo binario de péptidos que provocan una señal positiva basada en la unión del tetrámero (Método 1) o la liberación de IFNγ (Métodos 2 y 3). Los valores en los gráficos de citometría de flujo indican el porcentaje de la población celular total capturada dentro del cuadrante o cuadro delineado. Las secuencias de péptidos se encuentran en la Tabla complementaria 2. Protocolo de expansión rápida REP, violeta brillante BV421 421 nm, azul brillante BB515 515 nm, ficoeritrina PE, aloficocianina ACN, violeta brillante BV711 711 nm.

Para el Método 1 (Fig. 3a), usamos un protocolo bien establecido para generar líneas de células T específicas de antígeno específicas para los péptidos seleccionados25,26. Brevemente, los monocitos se aislaron de PBMC de donantes sanos (A*02:01 o A*24:02) y se maduraron en células dendríticas con un cóctel de citocinas. Las CD maduras se incubaron con 1 µg/mL de péptidos restringidos por HLA agrupados y luego se irradiaron. Esto promueve la presentación de los antígenos peptídicos por estas células DC al mismo tiempo que hace que las células DC no proliferen. Los linfocitos T CD8+ purificados a partir de PBMC autólogas se incubaron con estas DC cargadas con péptidos durante 8 a 10 días para inducir la estimulación selectiva y la expansión de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Las líneas de células T se estimularon dos veces de nuevo y se expandieron con PBMC autólogas irradiadas con pulsos de péptido. Para cada alelo HLA, este proceso se replicó 10 veces usando alícuotas separadas de células T CD8+ del donante compatible con HLA. Para probar la especificidad de estas poblaciones de células T expandidas para los 20 péptidos, preparamos cuatro grupos, cada uno compuesto por 5 tetrámeros SCT conjugados con diferentes fluorocromos. Las líneas individuales de cada donante compatible con HLA se analizaron luego mediante citometría de flujo de 5 colores (Fig. 3b, consulte la Fig. 3a complementaria para la estrategia de activación) utilizando estos conjuntos de tetrámeros SCT (consulte Métodos). De esta forma, el ensayo de citometría de flujo identifica qué antígenos promovieron expansiones clonales y cuáles fueron irrelevantes, y prueba la selectividad de unión contra esos antígenos relevantes. Se identificaron poblaciones de células T positivas para tetrámero de SCT de cada línea, con poca evidencia de reactividad cruzada entre los otros SCT relevantes e irrelevantes. Esto indica que para estos subconjuntos de péptidos y para cada donante, existen poblaciones de células T que se unen selectivamente a los péptidos presentados a través de células presentadoras de antígenos (APC) y también se unen a los SCT afines (Fig. 3b).

El éxito del Método 1 sugirió el potencial de un enfoque de biblioteca más grande para el aislamiento y la caracterización de células T específicas de antígeno. Por lo tanto, para el Método 2 (Fig. 3a), exploramos si una población de células T específicas de antígeno con una amplia diversidad de especificidades de antígeno podría identificarse a partir de un conjunto de células T policlonales cuando los SCT tetraméricos se agruparon en un formato de biblioteca. Primero evaluamos el Método 2 utilizando las líneas de células T enriquecidas con antígeno descritas anteriormente (Fig. 3b), donde se conocía la amplitud de las especificidades de antígeno disponibles. Todas las líneas de células T de cada donante se agruparon y tiñeron con una biblioteca agrupada de tetrámeros SCT, donde los 10 SCT se conjugaron con colorante de aloficocianina (ACN) y luego se combinaron como una solución de tinción única. La muestra se clasificó en busca de células T positivas para ACN (Fig. 3c.i), que luego se expandieron utilizando un protocolo de expansión rápida de células T (REP)27. Para evaluar la frecuencia de células T con especificidades de antígeno distintas dentro de esta población, evaluamos la producción de IFNγ por parte de las células expandidas en respuesta a cada péptido (Fig. 3c.ii, consulte la Fig. 3b complementaria para la estrategia de activación). Las células que respondieron contenían especificidades de células T que coincidían estrechamente con las encontradas en el Método 1 (Fig. 3e), lo que confirma que las células T que se unen a cada uno de los SCT probados son, de hecho, reactivas contra el péptido nativo. Por lo tanto, los Métodos 1 y 2 muestran que los SCT se pueden agrupar para capturar y promover la expansión de poblaciones de células T específicas de antígeno objetivo.

Para el Método 3 (Fig. 3a), preguntamos si podíamos usar la misma biblioteca de SCT para purificar poblaciones similares de células T a partir de células T CD8+ no manipuladas ex vivo aisladas de las PBMC del donante. Este enfoque optimizado puede eludir los 20 días de estimulación y expansión de péptidos facilitada por PBMC de los Métodos 1 y 2. Preparamos tetrámeros SCT conjugados con ACN en un formato de fluoróforo único combinado (idéntico al Método 2) para clasificar directamente (Fig. 3d .i) células T CD8+ no expandidas de los mismos donantes. Luego, las células T se expandieron usando el mismo REP (Fig. 3a). La Figura 3d.ii muestra las mediciones de la secreción de IFNγ de células T CD8+ clasificadas con tetrámero y expandidas de PBMC de donantes A*02:01 tras la estimulación con péptido individual. Se proporcionan datos adicionales en la figura complementaria 3c-e para los otros péptidos A * 02: 01 y A * 24: 02. En particular, los epítopos para los que se pudieron aislar las células T fueron muy similares en los tres métodos (Fig. 3e). Se observaron variaciones en la frecuencia de algunos TCR específicos de epítopo, lo que probablemente refleja diferencias en la afinidad del péptido y/o la expansión in vitro. El Método 3 demuestra así que el repertorio clonal en términos de reactividad peptídica podría recapitularse utilizando un SCT agrupado y un protocolo de expansión simplificado. Este método altamente eficiente también debería reducir el sesgo de expansión contra el repertorio nativo de TCR.

Los estudios anteriores se realizaron con epítopos virales inmunodominantes bien caracterizados. A continuación, evaluamos si este enfoque podría usarse de manera efectiva para evaluar los epítopos predichos de un patógeno menos caracterizado.

Para enumerar el panorama de epítopos de las células T CD8+ específicas del SARS-CoV-2, generamos SCT que codifican antígenos putativos. El algoritmo de predicción de unión NetMHC4.0 se usó para identificar secuencias peptídicas de 9 a 11 mer de la proteína espiga con una afinidad de unión de 500 nM o más fuerte28 a HLA-A*02:01, A*24:02 o B*07 :02. Identificamos 96, 51 y 33 péptidos para estos alelos, respectivamente, con cierta superposición con las listas publicadas de antígenos putativos29,30,31. Los SCT A * 02: 01 exhibieron niveles utilizables de expresión para epítopos en toda la proteína, excepto en la región transmembrana (TM), que tenía una expresión uniformemente débil (Tabla complementaria 3). La expresión de SCT B*07:02 mostró una preferencia por el dominio N-terminal (NTD), el sitio de escisión S1/S2 y partes de la subunidad S2 (Tabla complementaria 4), mientras que las SCT A*24:02 altamente expresadas se concentraron alrededor del NTD, el dominio de unión al receptor (RBD) y las regiones TM (Tabla complementaria 5). Se realizó el mismo proceso de predicción para la proteína Nsp3 (proteasa similar a la papaína, PLpro) para A*02:01 para producir 191 péptidos (Tabla complementaria 6). Todos los SCT se generaron utilizando la plantilla D9 (Fig. 2b). La biblioteca B*07:02 SCT también se expresó usando la plantilla D3. Si bien la mayoría de los SCT expresados con la plantilla D9 también se expresaron con la plantilla D3 (y viceversa), los niveles de expresión fueron generalmente más altos para D9 (Fig. 4a, b complementaria), lo que quizás sugiera que D9 es una plantilla superior. Los SCT expresados más fuertemente (ver Métodos) se ensamblaron en cuatro bibliotecas.

Primero usamos estas bibliotecas para preguntar si los epítopos inmunogénicos se compartían entre los participantes de COVID-19 compatibles con HLA. Los SCT de SARS-CoV-2 de cada biblioteca se ensamblaron en reactivos de tetrámero PE y se agruparon para teñir y clasificar las células T específicas de antígeno de las PBMC recolectadas de tres participantes por haplotipo HLA (Fig. 4a), más PBMC de un (nunca infectado) ) A*02:01 donante sano. Un SCT A*02:01 que expresa el péptido pp56 de CMV se conjugó con ACN-estreptavidina y sirvió como control. Luego, las células T capturadas se expandieron usando el REP, y la especificidad del antígeno se confirmó mediante citometría de flujo con tetrámeros SCT individuales (Fig. 4b). Se detectaron células T CD8+ específicas del SARS-CoV-2 contra los mismos epítopos en diferentes participantes (Fig. 4b), lo que sugiere que, para un haplotipo HLA dado, hay epítopos inmunodominantes presentes, de acuerdo con otros informes32,33,34,35, 36,37,38. De hecho, ciertas respuestas de células T específicas de antígeno detectadas aquí (contra los epítopos QYIKWPWYI, NYNYLYRLF, SPRRARSVA y YLQPRTFLL, aunque aquí se encontró que YLQPRTFFK era más inmunodominante), se informaron en otros lugares35,37,38,39. Tenga en cuenta que las poblaciones de células T específicas de CMV se detectaron inicialmente en las PBMC no expandidas de los dos participantes A*02:01 COVID-19 (1,22 % y 0,24 %) y se detectaron en 13,2 % y 7 % después de la expansión de células T, respectivamente, nuevamente lo que indica que las células T específicas de antígeno que descansan en la sangre podrían capturarse y expandirse con éxito utilizando tetrámeros SCT (Fig. 4c.i-iv complementaria).

un flujo de trabajo para la captura facilitada por SCT de células T CD8+ específicas del antígeno SARS-CoV-2, secuenciación de TCR de una sola célula y clonación de TCR en células T autólogas (creado con BioRender.com). b Células T CD8+ positivas para tetrámero de SCT de participantes con COVID compatibles con HLA para bibliotecas de SCT (n = 1). c Frecuencia de clonotipos de TCR únicos contra péptidos cuyos SCT produjeron un alto % de unión al tetrámero (recuadros rojos de (b)). d Gráficos de citometría de flujo representativos del flujo de trabajo de clonación de células T. Células T autólogas (di), células T después de la inactivación de TCR mediada por CRISPR (d.ii), células T tetrámeras + después de la clonación de TCR lentiviral (d.iii), células T tetrámeras + después de clasificar y REP (d.iv). Las secuencias de péptidos se encuentran en las Tablas complementarias 3–6. A2 A*02:01, A24 A*24:02, B7 B*07:02, proteasa similar a la papaína PLpro, P PLpro, pico S, ficoeritrina PE, aloficocianina ACN, protocolo de expansión rápida REP.

Para sondear el repertorio de TCR de las células T específicas del SARS-CoV-2, se tiñeron poblaciones expandidas seleccionadas con dextrámeros dCODE con código de barras de ADN cargados con SCT (Immudex) para permitir el emparejamiento del reactivo de captura de SCT con clonotipos de TCR específicos a través de 10 × -secuenciación celular (Fig. 4a). Para 7 SCT que representan 7 antígenos y 3 alelos HLA, identificamos un clonotipo predominante (Fig. 4c) y muchos clonotipos subdominantes. Varios de estos clonotipos fueron seleccionados para la clonación.

Se usaron células T CD8+ primarias de donantes sanos compatibles con HLA para clonar supuestos TCR específicos del antígeno del SARS-CoV-2. Se usó citometría de flujo (Fig. 4d) para monitorear los pasos clave en el proceso de clonación (ver Métodos), incluida la eliminación de CRISPR/Cas9 de las cadenas endógenas TCR α/β40 (Fig. 4d.i, ii). Se usaron tetrámeros SCT para evaluar tanto la efectividad de la transducción lentiviral de nuevos genes TCR α/β (Fig. 4d.iii) como la pureza de las células modificadas con TCR posteriormente expandidas (Fig. 4d.iv). Usando este proceso, preparamos clonotipos de células 31T que representan especificidades contra 13 antígenos diferentes de SARS-CoV-2 presentados por 3 alelos HLA, más 2 controles positivos.

Realizamos ensayos funcionales para confirmar que las células T diseñadas por TCR respondían a la estimulación con el péptido objetivo (Fig. 5a). Los linfocitos T diseñados con TCR específicos de SARS-CoV-2 se cocultivaron con APC41 compatibles con HLA en una relación efector-objetivo de 2:1 con y sin carga de péptido (1 µM). Incluimos A*02:01/NY-ESO-1157–165 y A*02:01/CMV pp56495–503 células T CD8+ modificadas con TCR específicas de antígeno como controles positivos.

a Ilustración de ensayos funcionales, incluidos los marcadores de activación y citotoxicidad secretados por células T después de la activación específica de antígeno, así como la liberación de LDH después de la destrucción de APC por células T (creado con BioRender.com). b Mapa de calor que representa los niveles medidos de proteínas secretadas o liberadas de clonotipos de células T con o sin estimulación peptídica (n = 2). Los TCR indicados en letra roja se identificaron de donantes sanos. c Obtención de imágenes de células vivas IncuCyte de estimulación de péptidos y actividad de eliminación de células. Las barras de escala en cada panel representan 400 μm. di Mediciones de la fracción de APC muertas del análisis de imágenes cinéticas de IncuCyte de los clonotipos de células T modificadas con TCR cocultivadas con APC. Las barras de error representan la desviación estándar de las mediciones independientes por triplicado. d.ii. Clasificación de clonotipos de células T por actividades de destrucción. Las secuencias de TCR se encuentran en la Tabla complementaria 7. LDH lactato deshidrogenasa, TNFα factor de necrosis tumoral α, IFNγ interferón γ, GzmB granzima B, NY SLLMWITQC (NY-ESO-1), CMV NLVPMVATV, A2 A*02:01, B7 B* 07:02, célula presentadora de antígeno APC, P PLpro, pico S.

Después de 16 h de cocultivo, analizamos el sobrenadante en busca de tres moléculas efectoras (TNF-α, IFN-γ y Granzyme B) que serían secretadas por las células T CD8+ primarias transducidas por TCR, así como la lactato deshidrogenasa (LDH ), que se libera de las células diana lisadas. Todas las proteínas se midieron mediante ELISA, excepto la LDH, que se evaluó mediante un ensayo estándar de citotoxicidad no radiactiva (ver Métodos). Los resultados de las mediciones se normalizan por separado según el valor más alto de cada lectura y se trazan en un mapa de calor. Todos los controles negativos y todos los TCR cocultivados con APC en ausencia del péptido objetivo (pero a la misma concentración de DMSO) produjeron niveles no detectables de proteínas funcionales así como LDH (Fig. 5b). Por el contrario, la mayoría de las células T específicas del SARS-CoV-2 (20/31), así como los controles positivos NY-ESO-1157–165 y las células T específicas del CMV pp56495–503 secretaron niveles detectables de moléculas efectoras y promovieron la apoptosis después de la activación. con APC cargado con el péptido correcto (Fig. 5b). Todos los clonotipos de células T específicos de SARS-CoV-2 produjeron niveles de granzima B superiores a los de los controles negativos, mientras que los subconjuntos produjeron TNF-α e IFN-γ. Se encontraron correlaciones positivas entre las tres moléculas efectoras y los niveles de LDH analizados (Fig. 5a-c complementaria) (TNF-α: r = 0,91, p <0,0001; IFN-γ: r = 0,87, p <0,0001; Granzima B: r = 0,67, p < 0,0001).

La destrucción de la diana por parte de las células T que expresan TCR-079 se evaluó con APC cargadas con o sin péptido afín 1 µM (RLITGRLQSL) en un ensayo de imágenes de células vivas Incucyte con un indicador de activación de caspasa (Fig. 5c). Para este ensayo, etiquetamos las APC con tinte de células vivas (rojo). Luego, estas células se cocultivaron con las células T CD8+ modificadas genéticamente (sin marcar) y con un reactivo que captura la activación de caspasa 3/7 (verde). Las imágenes fluorescentes se recogieron cada 20 min durante 12 h. La cuantificación de áreas fluorescentes verdes/rojas en cada punto de tiempo proporcionó la métrica para rastrear la cinética de destrucción de células objetivo. Para esta combinación de TCR/APC, la mayoría de los eventos de muerte celular ocurrieron dentro de las 4 h, lo que llevó a la erradicación casi completa de las APC. Este análisis reveló un amplio espectro de actividad de eliminación de células en los clonotipos diseñados por TCR (Fig. 5d.i) y una correlación positiva con el ensayo de medición de LDH (Fig. 5d complementaria).

Las curvas de muerte en el curso del tiempo (Fig. 5d.i) se ajustaron a funciones sigmoidales (ver Métodos) para extraer dos métricas de muerte comparativas para evaluar las diferencias entre los clonotipos de TCR. La primera métrica fue el valor EC50, que es el punto de la pendiente más pronunciada del ajuste sigmoidal a la curva de muerte, y la segunda métrica fue la proporción de células muertas/vivas a las 12 h (Fig. 5e complementaria). Este análisis definió tres grupos de TCR (Fig. 5d.ii). Las células T que expresan los TCR del grupo 1 (curvas azules en la Fig. 5d.i y círculos azules en la Fig. 5.d.ii) se etiquetaron como "rápidas y funcionales". Estas células exhibieron una respuesta de destrucción rápida (EC50 < 200 min) con una fracción de células vivas/muertas >0,9. El grupo 2 (verde; lento y funcional) exhibió una EC50 > 350 min pero una fracción de células vivas/muertas similar > 0,75 que el grupo 1. Los TCR del grupo 3 (naranja, no funcional) exhibieron una respuesta de destrucción deficiente. En la Tabla complementaria 7 se proporciona una lista completa de TCR, sus antígenos afines y sus agrupaciones. Tenga en cuenta que los controles positivos NY-ESO-1157–165 y CMV pp56495–503 se clasificaron como "funcionales". Estos datos muestran que los TCR emparejados con antígeno identificados a través del protocolo de la Fig. 4a reflejan el espectro completo de respuestas de células T específicas de antígeno, incluida una gran fracción de TCR altamente potentes.

La tecnología de biblioteca SCT presentada aquí permite el montaje de cientos de pMHC de una manera relativamente rápida y fácil. Estas bibliotecas, a su vez, permiten búsquedas altamente multiplexadas de poblaciones de células T CD8+ específicas de antígeno. La caracterización de las bibliotecas SCT reveló tendencias distintivas dependientes de péptidos en la expresión, la estabilidad térmica y la funcionalidad de SCT. Algunos péptidos han resultado difíciles de expresar en el formato SCT, y es posible que este problema se deba a que nuestra plataforma de expresión refleja en parte las afinidades de unión naturales de estos péptidos por el surco de unión HLA, como lo señalaron otros8, y por lo tanto pueden usarse como proxy para validar algoritmos de unión de péptidos. Por supuesto, también es posible que ciertos péptidos que son presentados por MHC en el formato biológico natural in vivo no sean susceptibles de preparación como un SCT, aunque esta limitación también puede aplicarse a pMHC plegados in vitro. Nuestro hallazgo de que los SCT producidos biológicamente pueden contener antígenos glicosilados puede ser notable. Dichos antígenos, especialmente los autoantígenos glicosilados en el contexto de enfermedades autoinmunes, son un tema de literatura reciente42. Si la tecnología de la biblioteca SCT puede proporcionar una nueva herramienta para explorar esta biología es una pregunta abierta.

Para el alelo HLA A * 02: 01, exploramos sistemáticamente cómo varias mutaciones informadas anteriormente en los dominios L1 y HLA influyeron en la expresión y función de SCT. Identificamos 3 plantillas (D3, D5 y D9) que produjeron patrones de expresión casi idénticos en 19 antígenos virales y asociados a tumores diferentes. Cuando se expresaron con el antígeno WT1, todos ellos también produjeron una captura selectiva y eficiente de células T específicas del antígeno WT1 modificadas por TCR C4αβ. Cada una de estas plantillas contenía dos cisteínas para proporcionar un puente disulfuro para promover la estabilidad de SCT y preservar el aminoácido H74 de tipo salvaje en lugar de usar el H74L para alterar la presentación del epítopo. Se demostró además que el epítopo de células T CMVpp65 CD8+ restringido por HLA-A*02:01 expresado con la plantilla D3 SCT captura un espectro similar de clonotipos de células T que el pMHC plegado correspondiente. Por lo tanto, aunque el pMHC plegado puede representar la conformación natural, múltiples plantillas de SCT parecen imitar adecuadamente esta conformación natural con respecto a la unión de TCR y también brindan ventajas significativas en términos de permitir la preparación de bibliotecas y proporcionar estabilidad a largo plazo. Una 'mejor' plantilla puede depender del alelo HLA. Por ejemplo, para una biblioteca de epítopos restringidos B*07:02, encontramos que las plantillas D9 y D3 produjeron patrones de expresión altamente correlacionados, pero la expresión general de las plantillas D9 fue superior.

La capacidad de construir grandes bibliotecas de SCT a través de múltiples alelos HLA permite fundamentalmente tanto la cuantificación a gran escala de respuestas de células T específicas de antígeno como la caracterización genética y funcional de los clonotipos de TCR identificados. Esto se demostró mediante la construcción y el uso de grandes bibliotecas SCT de SARS-CoV-2 restringidas de clase I para HLA-A*02:01, HLA-A*24:02 y HLA-B*07:02. Además, algunos de nosotros informamos recientemente sobre grandes bibliotecas de SCT en muchos alelos HLA A, B y C adicionales para identificar TCR que se trasladaron a la clínica para inmunoterapia de cáncer de transferencia celular adoptiva43. Ese documento fue principalmente un estudio clínico que solo describió brevemente la técnica de la biblioteca SCT, pero ofrece más evidencia de la versatilidad del método. Identificamos que ciertas células T CD8+ específicas del epítopo informadas anteriormente se detectaron dentro de las PBMC recolectadas de participantes con COVID-1932,33,34,35,36,37,38 pero a bajas frecuencias. En particular, también detectamos varios epítopos compartidos que solo se habían sugerido previamente como candidatos a vacunas de epítopos de células T en función de las predicciones de unión de péptidos MHC44,45,46. Los antígenos probados aquí se basaron en los predichos por NetMHC 4.0. Se han informado16 enfoques de predicción mejorados, basados en el uso de múltiples algoritmos, y podrían adaptarse para búsquedas más completas de poblaciones de células T específicas de antígeno. Por lo tanto, el enfoque de la biblioteca SCT puede permitir búsquedas a gran escala en un proteoma viral para cuantificar las respuestas de células T específicas de antígeno y puede proporcionar una herramienta que permita el diseño de vacunas de células T.

Las pruebas funcionales de los clonotipos de TCR emparejados con antígenos revelaron que las bibliotecas de SCT podrían usarse para capturar células T que exhiben una amplia gama de respuestas citotóxicas dependientes de TCR contra las células presentadoras de antígenos. Si bien todos los clonotipos de TCR se activaron selectivamente después de la exposición al antígeno, ese nivel de activación fue diverso. Respuestas tan diversas han sido previamente reportadas47,48,49. Los estudios mecánicos han revelado que la afinidad de unión de TCR-pMHC puede ser un factor influyente, pero que probablemente haya otros50,51,52. La naturaleza de alto rendimiento del enfoque de la biblioteca SCT debería proporcionar una herramienta nueva y poderosa para desarrollar una métrica completa. Si dicha métrica se puede aplicar de manera uniforme o si variará entre los antígenos virales, los neoantígenos tumorales, los antígenos de cáncer de testículo, etc., es una pregunta abierta pero que se puede abordar utilizando los métodos descritos aquí.

La cohorte del INCOV incluyó a 209 pacientes con SARS-CoV-2 (50% mujeres, con edades comprendidas entre los 18 y los 89 años con una media de 56 años), una ampliación de la cohorte previamente publicada sobre infección aguda53. Los participantes potenciales fueron identificados en cinco hospitales del Centro Médico Sueco y clínicas afiliadas ubicadas en la región de Puget Sound cerca de Seattle, WA. Todos los pacientes inscritos dieron su consentimiento informado por escrito en persona. Se obtuvieron muestras de control sanas de Bloodworks Northwest (Seattle, WA). La investigación siguió el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) en Providence St. Joseph Health con el número de estudio del IRB STUDY2020000175 y la Junta de Revisión Institucional Occidental (WIRB) con el número de estudio del IRB 20170658.

Los plásmidos codificados por SCT de clase I se construyeron utilizando una combinación de ensamblaje de Gibson y métodos de digestión con enzimas de restricción para la inserción en el plásmido pcDNA3.1 Zeo (+) (Thermo Fisher Scientific) (Fig. 1a). Brevemente, los insertos SCT se diseñaron para ser modulares y permitir que cualquier elección de L1 se emparejara con cualquier elección de alelo HLA. Debido a que β2m no tiene variación alélica en la especie humana, el SCT se dividió en dos fragmentos de ensamblaje de Gibson dentro de la región β2m para permitir el desacoplamiento de L1 de HLA. Los fragmentos se compraron en Twist Bioscience, se amplificaron por PCR con polimerasa KOD HotStart Hi-Fi (MilliporeSigma) y se unieron mediante ensamblaje Gibson utilizando NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (New England Biolabs). Las regiones flanqueantes del producto Gibson amplificado por PCR fueron digeridas por EcoRI y XhoI (New England Biolabs) para ligarse en la región MCS de pcDNA3.1 en los mismos sitios de reconocimiento de enzimas. La optimización de codones se aplicó a los fragmentos diseñados bajo tres consideraciones: (1) selección de solo codones altamente prevalentes en la especie humana, (2) evitación de segmentos de genes continuos (24+ pb) donde el contenido de GC está por encima del 60% (para evitar el fabricante tasas de error durante la síntesis), y (3) evitar los sitios de corte de reconocimiento clave dentro de los fragmentos, que solo deben existir en los flancos del producto Gibson para la inserción en el vector pcDNA. Posteriormente, el diseño del segundo fragmento (que codifica el alelo HLA) se automatizó con un script de Python, que abarca todos los criterios de diseño antes mencionados y tiene en cuenta todos los alelos de los loci HLA-A, B y C de clase I. Las secuencias de proteínas de cada alelo HLA se obtuvieron de un servidor FTP alojado por The Immuno Polymorphism Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/fasta/).

Se implementó un enfoque facilitado por PCR para permitir la sustitución de alto rendimiento de péptidos en plásmidos codificados por SCT. Brevemente, para cualquier sustitución peptídica dada, se requiere un cebador inverso codificado por péptido (que se une a la secuencia señal de IFNα2 cadena arriba de la región peptídica) y un cebador directo (que se une a la secuencia L1 cadena abajo de la región peptídica). Ambos cebadores tienen regiones de hibridación de 16 pb (cebador inverso: 5'-GCCAACAGAACAGCTG-3', cebador directo: 5'-GGTTGTGGAGGTTCTG-3'). El cebador inverso codificado por péptido varía para cualquier péptido dado, mientras que el cebador directo permanece fijo en todos los elementos peptídicos (a menos que se elija usar un plásmido molde L1/HLA diferente). Por lo tanto, el cebador inverso codificado por péptido normalmente se extenderá otros 27 a 33 pb para dar cuenta de la inserción de un péptido de 9 a 11 aminoácidos (p. ej., cebador inverso para la inserción del péptido YLQPRTFLL: 5′-CAGCAGGAAGGTTCTAGGCTGCAGGTAGCCAACAGAACAGCTG-3′ ). La PCR de extensión se realizó con polimerasa KOD Hot Start (MilliporeSigma). El producto se fosforiló y se ligó con una mezcla de polinucleótido quinasa de T4 y ADN ligasa de T4, y luego se digirió el ADN molde con DpnI (New England Biolabs). A continuación, los plásmidos sustituidos con péptido se transformaron en E. coli químicamente competente One Shot TOP10 (Thermo Fisher Scientific). Los plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger utilizando un script de Python antes de su uso en la transfección.

Los plásmidos SCT purificados se transfectaron en células Expi293 (Thermo Fisher Scientific) en placas de 24 pocillos (capacidad de 2,5 ml). Brevemente, se mezclaron 1,25 µg de plásmido con 75 µl de medio de suero reducido Opti-MEM. Se mezclaron 7,5 µl de ExpiFectamine Reagent con 70 µl de medio de suero reducido Opti-MEM, se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min y se combinaron con la mezcla de plásmidos. Después de una incubación a temperatura ambiente de 15 minutos, la solución se añadió a 1,25 ml de células Expi293 a 3 millones de células/ml en una placa de 24 pocillos, que luego se agitó a 225 RPM a 37 °C en CO2 al 8 % durante la noche. Veinte horas después, se añadió a cada pocillo una solución que contenía 7,5 µl de ExpiFectamine Transfection Enhancer 1 y 75 µl de ExpiFectamine Transfection Enhancer 2. La placa se mantuvo en el agitador utilizando los ajustes antes mencionados durante un total de 4 días desde el inicio de la transfección. El sobrenadante de la solución de transfección se recogió y se filtró a través de filtros de jeringa de membrana PVFD de 0,22 µm (MilliporeSigma) antes de realizar el análisis mediante SDS-PAGE. Las soluciones sobrenadantes de SCT que se expresaron con alto rendimiento se concentraron hasta 200 µl de PBS usando unidades de filtro centrífugo de 30 kDa (Amicon) y posteriormente se biotinilaron con el kit de enzimas BirA (Avidity) durante la noche. Luego, los SCT biotinilados se purificaron con puntas de resina HisTag (Phynexus) y se desalinizaron nuevamente en tampón PBS con columnas de desalinización por rotación Zeba 7 K MWCO (Thermo Fisher Scientific). Para el almacenamiento a largo plazo, los SCT se volvieron a suspender en glicerol al 20 % p/v antes del almacenamiento a -20 °C.

Después de 4 días de transfección, se desnaturalizó a 100 ◦C durante 10 min una solución de 15 µl que contenía una mezcla 3:1 de sobrenadante de transfección y tampón Laemmli con b-mercaptoetanol al 10 % y, posteriormente, se cargó en geles Bio-Rad Stain-Free para SDS. -PAGINA (200 V, 30 min). Una muestra de SCT de WT1 (RMFPNAPYL) A*02:01 purificada y reducida en una solución de PBS de glicerol al 20 % (que contiene aproximadamente 2 µg) se procesó en cada gel para servir como control positivo y referencia de intensidad para el cálculo del rendimiento relativo de proteína. Las imágenes se obtuvieron utilizando un sistema de formación de imágenes en gel Bio-Rad ChemiDoc MP (ajustes manuales: 45 s de activación UV, 0,5 s de exposición). Se desarrolló un script de Python personalizado para el análisis de proteínas SCT ejecutadas en geles sin manchas (Bio-Rad). El script permite una selección definida por el usuario de bandas de proteína de interés y proporciona una reducción de fondo y una normalización uniforme del rendimiento de SCT en todos los geles, dado el uso constante de un carril de proteína de control. La precisión de este enfoque se midió mediante SDS-PAGE de muestras tituladas y precuantificadas de SCT purificados para demostrar una correlación del 99 % entre la concentración de proteína A280 verdadera (medida por el espectrofotómetro NanoDrop 8000) y la intensidad de banda relativa cuantificada (Fig. 1 complementaria). ). Los SCT que se expresaron por encima de un límite establecido para el rendimiento (> 0,15 de intensidad relativa al estándar de control positivo WT1 SCT) se seleccionaron para los pasos posteriores de biotinilación y purificación.

SYPRO™ Orange Protein Gel Stain se adquirió de ThermoFisher Scientific y se diluyó con H2O para obtener una solución de trabajo 100X. A cada alícuota de 19 µl de solución de proteína SCT Clase II (diluida a 10 µM, si es posible), se añadió 1 µl de la solución de colorante 100X. Se utilizó un termociclador Bio-Rad equipado con un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 en combinación con el software Precision Melt Analysis para obtener las curvas de fusión de cada muestra SCT. Los ajustes de la rampa térmica fueron de 25 °C a 95 °C, 0,2 °C por 30 s.

Los tetrámeros se generaron combinando monómero SCT y estreptavidina conjugada con fluoróforo (Thermo Fisher Scientific) en una proporción molar de 4:1 en PBS para dar una concentración final de tetrámero SCT de 2 µM (con respecto al monómero SCT). Se añadió un exceso de biotina sin marcar para bloquear el sitio de unión de biotina libre en la estreptavidina. Después del ensamblaje, se usaron 20 nM de tetrámero (con respecto al monómero SCT) para teñir hasta 1 × 106 células. Los tetrámeros se almacenaron a 4 °C antes de la tinción.

Se generaron células dendríticas inmaduras (DC) a partir de PBMC de donantes sanos mediante incubación durante la noche con GM-CSF e IL-4. Las CD maduras se generaron mediante la incubación durante la noche de las CD inmaduras con TNF-α, IL-1ß, IL-6 y prostaglandina E-2. Las DC maduras se cargaron con 1 µg/mL de péptidos restringidos por HLA agrupados y se incubaron durante 4 h a 37 °C en un MACSmix™ Tube Rotator (Miltenyi Biotec). Las células T CD8+ se aislaron de PBMC autólogas utilizando el kit de enriquecimiento de células T CD8+ humanas EasySep™ (STEMCELL Technologies). Después de la incubación, las CD cargadas con péptido se irradiaron a 4000 RAD. Se generaron líneas (10/donante) combinando DC irradiadas con células T CD8+ e IL-21. Las líneas se incubaron a 37 °C y se mantuvieron cada 2 o 3 días con CTL, IL-2, IL-7 e IL-15. 10-14 días después de la generación de la línea, se llevó a cabo la estimulación 2 combinando PBMC irradiadas de los mismos donantes con células de la estimulación 1, péptidos agrupados a 1 ug/ml e IL-21. Este proceso se repitió para un total de tres estimulaciones. En el REP, las células T CD8+ se expandieron en presencia de Abs anti-CD3 (100 ng/mL), Abs anti-CD28 (100 ng/mL), IL2 (20 UI/mL), IL7 (10 ng/mL ), IL15 (10 ng/ml), PBMC mixtas irradiadas de los tres donantes sanos y líneas TM-LCL. El medio de cultivo celular se reponía a la mitad cada 3 días hasta los 14 días de cultivo.

Se mezclaron 4 μl de MHC replegados cargados con péptidos fotoescindibles (MHC-J) (0,5 μM) con 1 μl del péptido objetivo (50 μM) para intercambiar y se expusieron a UV de 365 nm durante 60 min en hielo. Se realizó un ensayo ELISA para cuantificar la eficiencia de intercambio UV como se describe a continuación. Brevemente, las placas de NeutraAvidin (ThermoFisher, 15507) se lavaron cuatro veces con tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween-20 al 0,05 % y BSA al 0,1 %) y se bloquearon con tampón de bloqueo (PBS que contenía BSA al 2 %) durante 1 h a la misma hora. 37˚C. Los pocillos se incubaron con 100 μL de muestras intercambiadas con UV o MHC-J a 5 nM durante 1 hora a 37 °C. Se utilizó como control positivo un complejo de MHC plegado fabricado internamente en ocho diluciones dobles en serie, a partir de 32 nM. Después de lavar cuatro veces con tampón de lavado, los pocillos se incubaron con anticuerpos β2m conjugados con HRP (Rockland, dilución 1:5k) en tampón de bloqueo durante 1 hora a 37 °C. Los pozos se lavaron cuatro veces nuevamente antes de incubar con 100 μL de sustrato TMB (Seracare, 5120‐0047). La reacción de TMB se extinguió después de 5 min utilizando ácido sulfúrico 1 M. La DO a 450 nm se midió en un lector de placas Spectramax. La eficiencia de intercambio de UV se calculó como la DO450 restada de fondo de las muestras intercambiadas con UV dividida por la DO450 restada de fondo de la muestra de MHC-J.

Los SCT de monómero se tetramerizaron individualmente con estreptavidina marcada con PE o APC en una proporción molar de 4:1 durante 30 min a 4 °C. Se añadió biotina en una proporción molar de 8:1 a la estreptavidina para bloquear los sitios de unión de biotina no ocupados en la estreptavidina. Cada tetrámero de SCT se agrupó a una concentración de tetrámero individual de 50 nM. Las PBMC se descongelaron recientemente, se lavaron y se tiñeron con violeta de calceína AM (100 nM) y anticuerpo CD8-FITC (1 μg/ml) durante 10 min a 4 °C seguido de incubación con un grupo de tetrámeros SCT (cada uno, 20 nM ). Los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno marcados con calceína violeta AM, anticuerpo anti-CD8 y SCT-tetrámero-PE se clasificaron a granel en el tubo que contenía un medio de cultivo celular (FACSAria Fusion). Los linfocitos T CD8+ clasificados se expandieron luego usando el REP. El medio de cultivo celular se reponía a la mitad cada 3 días hasta los 14 días de cultivo. Las células T clasificadas con tetrámero y expandidas se tiñeron con tetrámero individual, y las poblaciones de células T CD8+ positivas para tetrámero se analizaron mediante citometría de flujo (Attune NxT). Para el ensayo de IFN-γ después de la expansión, las células se recuperaron durante la noche y se incubaron con 1 µg/ml de péptido durante 12 ha 37 °C. Las células se tiñeron para la expresión de tetrámero y CD8, seguido de tinción intracelular para la producción de IFN-γ.

El dextrámero con código de barras de ADN se produjo mezclando el klickmer con código de barras de ADN y marcado con PE (Immudex) con el monómero SCT en una proporción molar de 1:28 durante 30 min a 4 °C, seguido de la adición de biotinas en exceso. Las células T CD8+ se aislaron mediante MACS y se tiñeron con anticuerpos de hashtag celular (BioLegend). Las células T etiquetadas y agrupadas se tiñeron con anticuerpo CD8-FITC (1 μg/ml) y una combinación de dextrámeros. Las poblaciones de células T CD8 y PE positivas se clasificaron y cargaron en un chip Chromium Next GEM G (10x Genomics, 1000120). Se utilizaron kits de células únicas de cromo (10x Genomics, 1000165) para analizar las secuencias de hashtag, TCR y antígeno simultáneamente de la misma célula. El ADNc de longitud completa, junto con los identificadores de código de barras de las células, se amplificó por PCR y se prepararon y normalizaron bibliotecas de secuenciación. La biblioteca construida se secuenció en la plataforma Novaseq (Illumina).

Las construcciones de ADN TCR α y β se amplificaron por PCR y Gibson se ensambló y se ligó en el vector lentiviral pRRL-SIN. El ADN del plásmido de secuencia verificada se transfecta en la línea de células 293 T junto con plásmidos de empaquetamiento para producir partículas lentivirales. Los linfocitos T CD8+ se aislaron de PBMC sanas utilizando el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD8+ humanos EasySep™ (STEMCELL Technologies) y se activaron con Dynabeads™ CD3/CD28 (Life Technologies) en una proporción de 1:1 de microesfera a célula durante 48 h en el presencia de IL2 (100 UI/mL).

Para generar C4ba TCR, las células se centrifugaron (2500 RPM, 30 °C, 90 min) con partículas lentivirales que codifican C4ba TCR en presencia de IL-2 y polibreno (Sigma-Aldrich). Las células se mantuvieron cada 2-3 días con medio CTL e IL-2. Después de CD8+, clasificación tetrámero positiva y REP, las células se tiñeron con tetrámero, CD8 y yoduro de propidio.

Para generar las líneas de células T específicas de SARS-CoV2, se preparó un complejo de Cas9 y sgRNA dirigido al primer exón del locus TRAC (AGAGTCTCTCAGCTGGTACA) y TRBC (GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC) y se sometió a electroporación en células T CD8+ a 3 pulsos de 1600 V y 10 ms usando electroporador de neón (Thermo Fisher Scientific). Luego, las células se transdujeron con partículas lentivirales que codifican el SARS-CoV2 TCR, y el medio se intercambió después de 12 h. Las células se mantuvieron cada 2-3 días con medio CTL e IL-2. Las células T transducidas se tiñeron con tetrámero y CD8 y se clasificaron mediante FACS y se expandieron usando un REP.

Todos los péptidos se sintetizaron usando procedimientos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc usando resina Wang. Se usó un instrumento Titan 357 (Aapptec) para acoplar todos los aminoácidos estándar protegidos con Fmoc. Una vez completada la síntesis, los péptidos se escindieron mezclándolos con 10 ml de solución de escisión (95 % de ácido trifluoroacético + 2,5 % de trietilsilano + 2,5 % de DI con agitación vigorosa durante 2 h. La solución resultante se añadió a 40 ml de éter dietílico (Acros Organics, 615080-0040), y luego el producto se peletizó por centrifugación, se secó al aire y luego se resuspendió en acetonitrilo al 30% (Fisher, A955-4). Los péptidos se purificaron en un sistema Waters Autopurification, que aísla compuestos basados en MS picos correspondientes a [M + 1H]+ y [M + 2H]2+ protonados Los péptidos resultantes se liofilizaron y se resuspendieron a una concentración de péptido de hasta 10 mM en DMSO.

Se cocultivaron células T CD8+ de 100 k clonadas con una línea de células T2 de 50 k emparejadas con HLA pulsadas con 1 µM del péptido en 200 µl de medio CTL. Después de 16 h de incubación, se extrajeron 50 µL de cada sobrenadante para su análisis mediante protocolos ELISA estándar para TNF-α (R&D Systems, DY210-05), IFN-γ (R&DSystems, DY285B-05) y Granzyme B (R&D Systems , DY2906-05) y por ensayo de citotoxicidad no radiactiva (Promega, G1780) para la medición de LDH. Cada experimento fue duplicado.

Antes del cocultivo de las células diana y las células efectoras, se aplicó la eliminación de células muertas tanto a las células diana como a las efectoras para agotar las células apoptóticas. Las células diana se tiñeron con colorante Cytolight Red (Sartorius, 4705) a una concentración de 0,33 µM en presencia de 1 µM del péptido. Se añadieron cien microlitros de medio CTL que contenía anticuerpo CD28 (100 ng/ml) y colorante Caspasa-3/7 (5 µM, Sartorius, 4440) en el pocillo de una placa de 96 pocillos. Se resuspendieron 50 k de células diana T2 pulsadas con péptido y 100 k de células T CD8+ sin marcar en cada 50 µl de medio CTL y se añadieron al pocillo. Para extraer la señal de células muertas solo de APC, se cuantificaron las áreas de superposición total (verde y rojo) y de objeto rojo (micrómetros cuadrados por pocillo), y la proporción de superposición a señal roja se interpretó como la muerte de las células objetivo. Se tomaron imágenes de las células en cuatro posiciones por pocillo cada 20 min durante 12 h. Las curvas de muerte para los clonotipos de TCR se trazaron a lo largo del tiempo y se ajustaron mediante regresión no lineal sigmoidal asimétrica.

Todos los datos se presentaron como la media ± DE de tres réplicas experimentales (a menos que se indique lo contrario en las leyendas de las figuras) y se analizaron utilizando la prueba t de dos colas para datos no apareados de Student. Un valor de p <0,05 denota diferencias estadísticamente significativas. El tamaño de la muestra utilizado para derivar cada estadística se proporcionó en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados en este estudio se proporcionan en el texto principal, la información complementaria, el archivo Excel de datos complementarios o están disponibles a los autores previa solicitud. Las imágenes sin procesar de los resultados de SDS-PAGE de las Figs. 1c y 2b se pueden encontrar en las Figs. complementarias. 1e y 2c, respectivamente. Los datos de secuenciación procesados generados en este estudio se han depositado en la base de datos ArrayExpress en EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) con el número de acceso E-MTAB-11229.

Los scripts de Python personalizados que se utilizan para el análisis de datos están disponibles públicamente en GitHub.

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Agradecemos a todos los participantes en este estudio y a los equipos médicos del Centro Médico Sueco por su apoyo. Agradecemos al Centro Genómico del Noroeste por su ayuda con los servicios de secuenciación y a la Unidad de Biobancos COVID-19 de ISB-Suecia. Agradecemos a los equipos de apoyo clínico y de investigación de SJHC/SJCI COVID-19. Agradecemos a Amazon Web Services por su apoyo a través de créditos de computación en la nube proporcionados por la Iniciativa de desarrollo de diagnóstico (DDI) de AWS. Reconocemos el apoyo financiero del Instituto Parker para la Inmunoterapia del Cáncer (JRH y PDG), la Autoridad de Investigación y Desarrollo Biomédico Avanzado (HHSO10201600031C a JRH) y los NIH a través de (1 R01 CA264090-01 JRH, PDG), (R21 AI154874 RKS) , y (R01 AI121242 RKS).

Estos autores contribuyeron igualmente: William Chour, Jongchan Choi.

Instituto de Biología de Sistemas, Seattle, WA, 98109, EE. UU.

William Chour, Jongchan Choi, Jingyi Xie, Alexander M. Xu, Yapeng Su, Daniel G. Chen, Rongyu Zhang, Dan Yuan, Sunga Hong, Alphonsus HC Ng, Rick A. Edmark, Lesley C. Jones, Kim M. Murray & james r heath

División de Biología e Ingeniería Biológica, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, 91125, EE. UU.

Guillermo Chour

Instituto de Ciencias e Ingeniería Molecular, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195, EE. UU.

Jingyi Xie

Programa en Inmunología, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, 98109, EE. UU.

Mary E. Chaffee, Thomas M. Schmitt, Kathryn Finton, Jonah Z. Butler, Roland K. Strong y Philip D. Greenberg

División de Biología Humana, Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson, Seattle, WA, 98109, EE. UU.

Diana C. DeLucía y John K. Lee

División de Química e Ingeniería Química, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, 91125, EE. UU.

Alexander M. Xu, Yapeng Su y Alphonsus HC Ng

Departamento de Microbiología y Departamento de Informática, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195, EE. UU.

Daniel G Chen

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195, EE. UU.

Rongyu Zhang, Dan Yuan y James R. Heath

PACT Pharma, San Francisco Sur, CA, 94080, EE. UU.

cantando peng

Instituto de Medicina de Sistemas, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Pekín, 100005, China

guíang li

Instituto de Medicina de Sistemas de Suzhou, Suzhou, 215123, China

guíang li

Elemento Regulador del Laboratorio Clave de Biología Sintética, Academia China de Ciencias Médicas, Beijing, China

guíang li

División de Oncología Médica, Departamento de Medicina, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195, EE. UU.

John K. Lee y Philip D. Greenberg

Centro Sueco de Investigación e Innovación, Centro Médico Sueco, Seattle, WA, 98104, EE. UU.

jason d goldman

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195, EE. UU.

jason d goldman

Departamento de Inmunología, Universidad de Washington, Seattle, WA, 98195, EE. UU.

Felipe D. Greenberg

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WC, JC y JRH concibieron este estudio. WC, JC, TMS, KF, DCD, AMX, YS, AHCN y JRH diseñaron los experimentos. WC, JC, JXMEC, DCD, YS, DGC, RZ, DY, SH, AHCN, JZB, RAE y LCJ realizaron los experimentos. WC, JC, JX, TMS, KF, DCD, AMX, YS, DGC, RZ y DY realizaron los análisis. SP, GL, KMM, RKS, JKL, JDG, PDG y JRH proporcionaron recursos. WC, JC y JRH escribieron el documento. Todos los autores participaron en la edición y revisión del artículo.

Correspondencia a James R. Heath.

JRH es fundador y miembro de la junta de Isoplexis y PACT Pharma. PDG forma parte del consejo asesor científico de Celsius, Earli, Elpiscience, Immunoscape, Rapt, Metagenomi y Nextech, fue uno de los fundadores científicos de Juno Therapeutics y recibe apoyo para la investigación de Lonza. JDG declaró investigación contratada con Gilead, Lilly y Regeneron y formó parte de una junta asesora de Gilead. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Communications Biology agradece a Tengchuan Jin y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Gene Chong. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Chour, W., Choi, J., Xie, J. et al. Grandes bibliotecas de péptidos-MHC de trímero de cadena única permiten el descubrimiento y el análisis de células T CD8+ específicas de antígeno. Commun Biol 6, 528 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04899-8

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Recibido: 08 noviembre 2022

Aceptado: 01 mayo 2023

Publicado: 16 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04899-8

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